1. 冷凍掃描電鏡概述

    常規(guī)掃描電鏡要求所觀察的樣品無水，而一些樣品在干燥過程中會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，致使無法觀察其真實(shí)結(jié)構(gòu)。冷凍掃描電鏡技術(shù)能夠?qū)ㄈ軇悠愤M(jìn)行成像和分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)于液態(tài)樣品（如乳液、囊泡等）及不耐電子束損傷樣品的微觀形貌的觀察。在冷凍掃描電鏡觀察前，液態(tài)樣品經(jīng)過低溫冷凍固定、斷裂、鍍膜（噴金/噴碳）等制樣處理后，再通過冷凍傳輸系統(tǒng)將其置于電鏡內(nèi)的冷臺(tái)（溫度可至-185℃即可進(jìn)行觀察。其中，快速冷凍技術(shù)可使水在低溫狀態(tài)下呈玻璃態(tài)，減少冰晶的產(chǎn)生，從而不影響樣品本身結(jié)構(gòu)，冷凍傳輸系統(tǒng)保證樣品傳輸過程中保持低溫狀態(tài)，整個(gè)系統(tǒng)從制樣到觀察都在低溫下進(jìn)行，盡可能保持樣品在液相中的原位結(jié)構(gòu)。

    2. 系統(tǒng)組成及流程

    冷凍掃描電鏡系統(tǒng)包括冷凍固定、冷凍斷裂、升華及導(dǎo)電性噴涂等制樣設(shè)備，冷凍傳輸裝置及掃描電鏡的冷臺(tái)，樣品首先經(jīng)過高壓冷凍或液氮泥方法進(jìn)行冷凍固定，然后在冷凍條件下傳輸?shù)秸婵諡R射儀中進(jìn)行斷裂，露出樣品新鮮的斷裂面，并根據(jù)樣品情況進(jìn)行升華防止表面被冰包覆，之后進(jìn)行導(dǎo)電性噴涂，至此制樣完成，通過冷凍傳輸系統(tǒng)將樣品置于掃描電鏡的冷臺(tái)進(jìn)行觀察。分析測(cè)試中心電鏡組現(xiàn)有的冷凍掃描電鏡系統(tǒng)包括高壓冷凍儀 Leica EM HPM100、冷凍傳輸樣品桿 Leica EM VCT100、離子濺射儀 Leica EM ACE600、自制的液氮泥冷凍裝置、冷凍掃描電鏡用的冷臺(tái)。

    2.1 冷凍固定

    2.1.1 高壓冷凍固定

    冷凍固定的目標(biāo)是在低溫下使液態(tài)樣品中的水不結(jié)晶而呈玻璃態(tài)，這樣既能將樣品在液相的狀態(tài)固定，又避免了水結(jié)晶引起樣品結(jié)構(gòu)的破壞。因此，冷凍固定的關(guān)鍵是要阻止冰晶形成，冷凍固定是否成功，取決于冷凍過程迅速通過一個(gè)溫度范圍，即水開始結(jié)晶的溫度到開始重結(jié)晶的溫度區(qū)間，此區(qū)間受環(huán)境壓力、樣品濃度等因素的影響。如圖 1[1]所示，第一行是常壓下的純水，從 273 K 開始結(jié)晶，因考慮到過冷水的作用，所以從 231 K 開始結(jié)晶，當(dāng)溫度低于重結(jié)晶溫度 136 K 時(shí)，結(jié)晶過程停止。第二行是常壓下的樣品，通常樣品包含溶質(zhì)會(huì)降低樣品的熔點(diǎn)（與溶質(zhì)濃度有關(guān)系），同時(shí)提高重結(jié)晶溫度，使得結(jié)晶的溫度區(qū)間減小。第三行是施加 204.5 MPa 壓力的樣品，可以看出，施加高壓會(huì)進(jìn)一步降低樣品的熔點(diǎn)且提高重結(jié)晶的，所以結(jié)晶的溫度區(qū)間進(jìn)一步減小。

    因此，可用高壓冷凍的方式將液態(tài)樣品進(jìn)行快速冷凍固定，具體如圖 2[1]所示，在 10ms 內(nèi)，壓力由常壓瞬間升高至約 200 MPa，同時(shí)用液氮使樣品溫度迅速下降，當(dāng)通過水的結(jié)晶區(qū)間，直到溫度低于約 136 K 后，即形成玻璃態(tài)的水。對(duì)于 200 ?m [3]厚的樣品，樣品中心區(qū)域通過這一溫度區(qū)間大約需要 30 ms。

    具體操作流程如下，用移液槍將待測(cè)樣品滴入冷凍樣品夾片的下片，下片中有凹槽，可儲(chǔ)存一定量的液體樣品，然后蓋上夾片上片，組成一個(gè)三明治結(jié)構(gòu)，上下兩片的材質(zhì)均為銅鍍金，之后將載有樣品的整個(gè)夾片置于綠色的固定片上，推入高壓冷凍儀中即可進(jìn)行高壓冷凍固定（圖 3），每次進(jìn)行一次高壓冷凍，儀器會(huì)生成一條冷凍曲線，根據(jù)曲線中達(dá)到目標(biāo)壓力和溫度的時(shí)間可初步判斷冷凍固定的效果。

    2.1.2 液氮泥冷凍固定

    高壓冷凍固定的方法雖然能較好的使水固定在玻璃態(tài)，但是高壓會(huì)影響某些樣品的微觀結(jié)構(gòu)，而且高壓冷凍儀價(jià)格昂貴。還可應(yīng)用液氮方式進(jìn)行冷凍固定，即將液氮置于真空中，在一定的負(fù)壓下（通常200Pa） [3]，液氮由液態(tài)逐漸變?yōu)楣虘B(tài)，形成液氮泥。由于萊頓弗羅斯特效應(yīng)（指液體不會(huì)潤(rùn)濕炙熱的表面，而僅僅在其上形成一個(gè)蒸汽層的現(xiàn)象），當(dāng)直接將樣品放入液氮中時(shí)，樣品周圍的液氮會(huì)立即沸騰，將樣品包裹在絕緣的氮?dú)庵?，從而使樣品不能立即降溫，水成為結(jié)晶態(tài)。而將樣品置于液氮泥中，由于液氮泥不存在沸騰現(xiàn)象，所以樣品不會(huì)收到萊頓弗羅斯特效應(yīng)的影響，可迅速降溫通， 使得水分子來不及重排成晶體，從而形成玻璃態(tài)的水。 如果是液體樣品，可用夾片裝載樣品直接投入到液氮泥中進(jìn)行冷凍固定，固體樣品則可直接用低溫膠粘在樣品臺(tái)上投入液氮泥中進(jìn)行固定。

    2.2 冷凍斷裂/噴涂

    將應(yīng)用高壓冷凍或液氮泥冷凍固定的樣品在液氮中轉(zhuǎn)移至冷凍樣品臺(tái)裝載裝置中，在其中將冷凍好的樣品裝載于冷凍傳輸樣品桿上。然后通過冷凍傳輸樣品桿將載有樣品的樣品臺(tái)轉(zhuǎn)移至 EM ACE600 濺射儀中（圖 4）應(yīng)用濺射儀中的刀對(duì)樣品進(jìn)行冷凍斷裂，露出樣品新鮮的斷面，對(duì)于有些樣品，在 173K 下進(jìn)行升華，避免樣品被水包裹覆蓋，之后進(jìn)行導(dǎo)電性噴涂，避免在掃描電鏡觀察過程中放電現(xiàn)象的發(fā)生（圖 5）。

    2.3 冷凍掃描電鏡觀察

    通過冷凍傳輸樣品桿將斷裂、噴涂好的樣品轉(zhuǎn)移至掃描電鏡的冷臺(tái)，冷臺(tái)是由液氮降溫經(jīng)銅帶導(dǎo)溫來控制溫度（ 123K），在掃描電鏡觀察時(shí)，通常應(yīng)用較低的加速電壓和較小的束流，以減弱放電現(xiàn)象和電子束對(duì)樣品的損傷。由于整個(gè)傳輸及觀察過程都保持在低溫狀態(tài)，所以盡可能的保持了樣品在液相的原位結(jié)構(gòu)。

    3. 冷凍掃描電鏡的應(yīng)用實(shí)例

    3.1 微乳液

    圖 6 為微乳液樣品分別經(jīng)高壓冷凍和液氮泥冷凍固定，并經(jīng)冷凍斷裂/噴涂后，傳輸?shù)嚼鋬鰭呙桦婄R得到的形貌圖，可以看出冷凍方法能夠保持乳液中液滴的結(jié)構(gòu)，液滴大小不一， 2 ?m 至 20 ?m。但是應(yīng)用高壓冷凍方法制得的樣品，液滴呈橢球型，可能是由于液滴受高壓擠壓而變形所致，而應(yīng)用液氮泥制樣得到的樣品液滴呈球型，保持了其本來的形貌。

    3.2 納米片穩(wěn)定的水包油體系

    圖 7 為用納米片穩(wěn)定的微乳液經(jīng)液氮泥冷凍固定、并經(jīng)冷凍斷裂/噴涂后，傳輸?shù)嚼鋬鰭呙桦婄R得到的形貌圖，可以看出納米片包覆在油滴表面，并且沿一定的方向排列，據(jù)此可以得出納米片在水包油穩(wěn)定體系中的存在狀態(tài)，從而推斷穩(wěn)定機(jī)理。

    圖 7 為用納米片穩(wěn)定的微乳液經(jīng)液氮泥冷凍固定、并經(jīng)冷凍斷裂/噴涂后，傳輸?shù)嚼鋬鰭呙桦婄R得到的形貌圖，可以看出納米片包覆在油滴表面，并且沿一定的方向排列，據(jù)此可以得出納米片在水包油穩(wěn)定體系中的存在狀態(tài)，從而推斷穩(wěn)定機(jī)理。

    3.3 磷脂、二肽分子自組裝體

    圖 8 是磷脂、二肽分子自組裝體經(jīng)液氮泥冷凍固定并經(jīng)冷凍斷裂/噴涂后，傳輸?shù)嚼鋬鰭呙桦婄R得到的形貌圖，可以看出分子組裝成棒狀結(jié)構(gòu)，棒的粗細(xì)在 500nm，每根棒又是由多根纖維組成。

    3.4 水凝膠

    圖 9 是水凝膠分別經(jīng)過冷凍干燥之后在常溫掃描電鏡上觀察到的形貌圖和經(jīng)液氮泥冷凍固定并經(jīng)冷凍斷裂/噴涂后，傳輸?shù)嚼鋬鰭呙桦婄R得到的形貌圖?？梢钥闯隼鋬龈稍锏乃z孔徑較大且稀疏，可能是由于水分在真空中揮發(fā)后樣品因?yàn)闆]有水分的填充導(dǎo)致孔塌陷。而未經(jīng)過可以看出孔徑很小且密集，因?yàn)檎婵崭稍锏乃z在冷凍固定的時(shí)候有水分填充，不會(huì)導(dǎo)致樣品塌陷，因此冷凍掃描電鏡的方法保持了水凝膠本身的結(jié)構(gòu)。

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