生物活動(dòng)所引起的腐蝕和污損已被公認(rèn)為是引起海洋鋼鐵構(gòu)筑物諸如石油平臺(tái)、管線、碼頭、船舶等腐蝕破壞的重要原因，給海洋工程的安全服役帶來嚴(yán)重隱患，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)侯保榮院士主持的中國工程院重大咨詢項(xiàng)目的調(diào)查報(bào)告，2014年我國的腐蝕總成本約占當(dāng)年國民生產(chǎn)總值的3.34%,總額超過2萬1千億元人民幣。其中，海洋腐蝕損失約占總腐蝕損失的1/3。

    潔凈的材料浸入海水后，在數(shù)秒到更長的時(shí)間內(nèi)，水中的有機(jī)分子、微生物以及其他海洋生物會(huì)陸續(xù)在其表面附著。這一過程通常可劃分為4個(gè)階段，即形成條件層、微生物附著形成生物膜、軟體宏觀污損和硬體宏觀污損。在整個(gè)過程中，海洋生物與材料表面發(fā)生復(fù)雜的物理化學(xué)作用，引發(fā)嚴(yán)重的微生物腐蝕和生物污損問題。

    海洋材料表面微生物的附著、生長、繁殖、代謝、死亡等過程中所產(chǎn)生的物質(zhì)直接或間接對(duì)材料造成的腐蝕稱之為微生物腐蝕。統(tǒng)計(jì)表明，與海洋微生物附著有關(guān)的材料破壞占到涉海材料總量的70%~80%。微生物的存在可顯著增大腐蝕速率，以碼頭中鋼結(jié)構(gòu)為例，微生物腐蝕引起的腐蝕速率最大可達(dá)4 mm/a,平均腐蝕速率也達(dá)0.3 mm/a。

    海洋生物在船體或水上設(shè)施表面的附著積累稱為海洋生物污損，這是人類自開發(fā)利用海洋以來就面臨的難題。生物污損的危害主要表現(xiàn)在降低船舶航速、影響海洋工程設(shè)施的安全運(yùn)轉(zhuǎn)、增加燃料消耗、阻塞隔膜管道、增加有害氣體排放、危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等。

    近年來眾多學(xué)者對(duì)中國近海碼頭，如旅順港、青島港、洋山港、廈門港、大亞灣碼頭、廣西白龍碼頭等污損生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果表明，不同碼頭優(yōu)勢(shì)污損生物種類和數(shù)量不同，主要優(yōu)勢(shì)污損生物有柄海鞘、苔蘚蟲、紫貽貝、大型海藻、牡蠣、中胚花筒螅、泥藤壺、白脊藤壺、僧帽牡蠣等，但是以上這些調(diào)查均針對(duì)宏觀污損生物。

    目前，對(duì)于實(shí)海掛片微生物的調(diào)查情況國內(nèi)已有一定的報(bào)道。林燕順等在廈門港進(jìn)行冬季掛片，顯示掛片1 h的不銹鋼片上有細(xì)菌出現(xiàn)，掛放24 h后附著細(xì)菌絕大多數(shù)為革蘭氏陰性球菌或短桿菌，主要有7種好氧優(yōu)勢(shì)菌，包括假單胞菌屬、黃單胞菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、黃桿菌屬、微球菌屬等；掛放7 d后整個(gè)試板表面已覆蓋有其他形態(tài)生物的復(fù)雜群落。吳進(jìn)怡等[11]報(bào)道了海口海水中25鋼片銹層中的微生物主要包括假單胞菌、弧菌、鐵細(xì)菌、硫桿菌及硫酸鹽還原菌 （SRB） 等；于洋等報(bào)道了煙臺(tái)近海聚氯乙烯 （Poly vinylchloride,PVC） 板掛片上的微生物主要有假交替單胞菌、芽孢桿菌、鹽單胞菌、嗜冷桿菌、腸桿菌等。以上研究標(biāo)志著人們開始關(guān)注實(shí)海掛片微生物，不足之處在于研究多集中于某個(gè)海域的全浸區(qū)，而對(duì)不同海域不同腐蝕區(qū)帶掛片樣品銹層中微生物的對(duì)比調(diào)查卻少有報(bào)道。

    本實(shí)驗(yàn)選擇實(shí)際應(yīng)用的海洋工程材料Q235碳鋼，分別于黃海 （青島）、南海 （三亞） 海域的不同腐蝕區(qū)帶 （潮差區(qū)、全浸區(qū)） 進(jìn)行實(shí)海掛片，采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法和16S rDNA序列分析技術(shù)，從其銹層中分離獲得可培養(yǎng)的微生物。并對(duì)比分析不同時(shí)空下全浸區(qū)、潮差區(qū)細(xì)菌種類的差別，為后續(xù)微生物腐蝕研究菌種的科學(xué)選擇提供基礎(chǔ)。

    1 實(shí)驗(yàn)方法

    1.1 樣品規(guī)格及處理

    實(shí)驗(yàn)中所用掛片試樣為200 mm×100 mm×5 mm的Q235碳鋼，其化學(xué)成分 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%） 為：C 0.18,Si 0.02,Mn 0.45,S 0.02,P 0.03,Fe余量。試樣用砂紙逐級(jí)打磨至800#,并打孔標(biāo)記。所有試樣在掛片前分別經(jīng)丙酮去油、酒精脫水和干燥處理。將試樣分別掛在鋼鐵研究總院青島腐蝕研究所小麥島實(shí)驗(yàn)站和中國中船重工七二五研究所三亞腐蝕實(shí)驗(yàn)站的潮差區(qū)和全浸區(qū)，掛片時(shí)間為90,180和270 d。

    1.2 腐蝕速率的計(jì)算

    用硬毛刷除去試樣表面的腐蝕產(chǎn)物，按照GB/T16545-2015規(guī)定的方法，采用含六次甲基四胺的HCl水溶液去除試片上的腐蝕產(chǎn)物后，再用去離子水沖洗，并用無水乙醇清洗后吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干，放入干燥器中衡重。稱重后與掛片前相比，計(jì)算出掛片的腐蝕失重與腐蝕速率。

    1.3 腐蝕產(chǎn)物的分析

    為研究銹層的組成，使用潔凈刀片刮取試片表面的腐蝕產(chǎn)物，烘干后研缽研成粉末。將所得樣品放入真空干燥器以備進(jìn)行X射線衍射 （XRD） 分析 （UitimaIV型，CuKα射線，掃描速率10°/min,掃描范圍5°~80°），判定其組成。

    1.4 銹層內(nèi)微生物的獲取

    達(dá)到掛片時(shí)間的樣品，取樣時(shí)先用數(shù)碼相機(jī)拍照，盡量不要碰掉銹層，放置在干凈、裝海水的食品袋中，轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室無菌超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行可培養(yǎng)微生物的分離，用事先滅菌的海水沖洗表面盡可能去除環(huán)境中的細(xì)菌。用鑷子刮取銹層表面及內(nèi)部，并用無菌海水沖洗銹層，獲得微生物分散液。

    1.5 腐蝕與污損微生物的分離

    將盛有銹層微生物分散液的燒杯，用無菌槍頭盡量吹打混勻。按照10倍梯度稀釋的方法，將混合液進(jìn)行稀釋，然后分別將稀釋10,100及1000倍3個(gè)梯度的稀釋液涂布于事先準(zhǔn)備好的2216E、檸檬酸鐵銨平板培養(yǎng)基 （成分與用途詳見表1）。并采用GB/T14643.5-93中規(guī)定的方法以特定培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧菌SRB的分離。將涂布平板放置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24~72 h。

    1.6 微生物的純化

    2216E平板一般生長24~48 h即有明顯的單菌落，檸檬酸鐵銨培養(yǎng)基一般要達(dá)到72 h以上才有明顯菌落生長，將平板上明顯的單菌落進(jìn)行三區(qū)劃線培養(yǎng)于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基。重復(fù)2~3次，確保所獲得菌株為純培養(yǎng)后，再擴(kuò)大培養(yǎng)并保存菌株。

    1.7 微生物的鑒定

    對(duì)分離純化的菌種進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR），首先取100 μL菌懸液，10000 r/min離心2 min后，去除培養(yǎng)基再加入80 μL的無菌水，吹打混勻后水浴煮沸10 min,再次離心即獲得模板。使用16S rDNA的一對(duì)通用引物1492R/27F進(jìn)行菌落PCR,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到目的條帶約在1400bp的產(chǎn)物送去青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果在NCBI BLAST進(jìn)行序列比對(duì)得到鑒定結(jié)果。

    2 結(jié)果與討論

  2.1 掛片樣品腐蝕形貌觀察

    圖1和2給出了Q235碳鋼實(shí)海掛片180 d的部分代表性形貌圖。可以看出，180 d后試樣的表面完全被腐蝕產(chǎn)物覆蓋。圖1中青島掛片樣品腐蝕產(chǎn)物顏色偏磚紅色和棕色，而圖2中三亞掛片樣品腐蝕產(chǎn)物顏色偏黑紅色且掛片樣品伴有泥沙。兩個(gè)海域全浸區(qū)掛片樣品外層形成了疏松的腐蝕產(chǎn)物層，內(nèi)層呈黑色淤泥狀；潮差區(qū)銹層較厚，出現(xiàn)裂紋，海水中Cl-等腐蝕性離子迅速透過裂紋與基體接觸，促使腐蝕速率增加。且在銹層中微生物的分離實(shí)驗(yàn)過程中，全浸區(qū)腐蝕產(chǎn)物易脫離試樣表面，潮差區(qū)腐蝕產(chǎn)物很難剝離。

    2.2 掛片腐蝕失重分析

    不同時(shí)空下不同腐蝕區(qū)帶Q235碳鋼實(shí)海掛片平均腐蝕速率見表2。可以看出，各海域不同腐蝕區(qū)帶平均腐蝕速率有所差別，相同掛片時(shí)間下潮差區(qū)的均高于全浸區(qū)的 （約高出2倍）。這一結(jié)果與朱相榮等報(bào)道結(jié)果一致。

    本實(shí)驗(yàn)掛片起始時(shí)間為4月份，掛片周期為90和180 d,所得到的平均腐蝕速率相較于已報(bào)道的長期腐蝕數(shù)據(jù)偏大。以青島海域?yàn)槔煜鄻s等報(bào)道的Q235碳鋼在全浸區(qū)、潮差區(qū)掛片1 a的平均腐蝕速率分別為0.19和0.22 mm/a;夏蘭廷等報(bào)道的Q235碳鋼掛片4 a的平均腐蝕速率在全浸區(qū)為0.13~0.14、潮差區(qū)為0.12~0.18 mm/a。這一偏差的出現(xiàn)與實(shí)海掛片腐蝕速率隨時(shí)間的延長而減緩的普遍規(guī)律相一致。

    2.3 腐蝕產(chǎn)物成分分析

    青島實(shí)海潮差區(qū)掛片180 d腐蝕產(chǎn)物外層成分復(fù)雜，主要有Fe3O4,α-FeOOH和γ-FeOOH,其中γ-FeOOH是主要成分 （圖3a）。這與鄒妍等報(bào)道Q235碳鋼在海水中浸泡126 d時(shí)，外銹層主要是由γ-FeOOH組成的結(jié)果相一致[15]。內(nèi)層腐蝕產(chǎn)物主要是Fe3O4和α-FeOOH。掛片180 d全浸區(qū)腐蝕產(chǎn)物外層主要是Fe3O4,α-FeOOH和γ-FeOOH,內(nèi)層主要是Fe3O4 （圖3b）。這與García的理論相一致，即越靠近金屬表面溶解氧的含量越少，越有利于Fe3O4的形成，因此Fe3O4總是在靠近金屬表面的區(qū)域形成。

    與青島海域掛片結(jié)果相似，三亞實(shí)海潮差區(qū)和全浸區(qū)掛片6個(gè)月外層腐蝕產(chǎn)物主要成分也為Fe3O4,α-FeOOH和γ-FeOOH;同時(shí)，F(xiàn)e3O4在內(nèi)層腐蝕產(chǎn)物中占比大 （圖4）。因此，在青島和三亞海域Q235碳鋼腐蝕產(chǎn)物成分差別不大。

    2.4 掛片銹層內(nèi)SRB分離結(jié)果

    SRB是最為典型的腐蝕微生物。依照最大可能計(jì)數(shù)法 （MPN法） 的結(jié)果 （表3），不同時(shí)空下Q235碳鋼實(shí)海掛片全浸區(qū)銹層內(nèi)均檢測到SRB,而潮差區(qū)銹層內(nèi)均未檢測到SRB。附著在金屬表面的海洋生物阻礙了O的擴(kuò)散，有利于減緩金屬的腐蝕，但這層覆蓋物中的好氧細(xì)菌能耗盡溶解氧成為生化障礙層，在金屬表面形成厭氧環(huán)境，為SRB提供良好的生長繁殖條件，從而加速金屬的腐蝕。這也是本實(shí)驗(yàn)在全浸區(qū)可以檢測到SRB的主要原因，全浸區(qū)可形成SRB生存的厭氧條件；而潮差區(qū)一直處于干濕交替狀態(tài)，加上O2含量較為豐富，不利于SRB的存活。

    2.5 掛片銹層內(nèi)鐵細(xì)菌分離結(jié)果

    鐵細(xì)菌 （IOB） 是生活在含有高濃度Fe2+的池塘、湖泊、沼澤、污水排放管道、溫泉等水域中，能將二價(jià)鐵鹽氧化成三價(jià)鐵化合物，并能利用此氧化過程中產(chǎn)生的能量來同化CO2進(jìn)行生長的細(xì)菌的總稱[20]。IOB是參與Fe的氧化以及這些元素可溶性氧化物的沉淀過程的一類微生物,具有使Fe的氫氧化物沉淀的能力，然后Fe3+以Fe（OH）3的形式沉淀下來。有研究表明，IOB在鐵銹的形成過程中發(fā)揮重要作用，其能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量鐵氧化物，并會(huì)對(duì)碳鋼造成局部腐蝕。研究較多的鐵細(xì)菌是生活在好氧或微好氧環(huán)境中的球衣菌屬、纖發(fā)菌屬、泉發(fā)菌屬、嘉利翁菌屬和假單胞菌屬等。

    表4為Q235碳鋼實(shí)海掛片銹層內(nèi)分離鐵細(xì)菌的情況。對(duì)比可見，三亞海域分離得到的鐵細(xì)菌種類高于青島海域，且全浸區(qū)較潮差區(qū)更易分離到鐵細(xì)菌。已分離鑒定的鐵細(xì)菌主要集中在弧菌屬 （Vibrio sp.）、交替單胞菌屬 （Alteromonas sp.）、假單胞菌屬 （Pseudomonas sp.）、芽孢桿菌屬 （Bacillus sp.）、節(jié)桿菌屬 （Arthrobacter sp.）、希瓦氏菌屬 （Shewanella sp.） 等12個(gè)屬內(nèi)。Zakharova等從貝加爾湖沉積物中分離得到19株鐵細(xì)菌，主要屬于鞘鐵細(xì)菌、瑙曼氏菌屬、芽孢桿菌屬3個(gè)屬。Ashassi-Sorkhabi等從下水道污水處理裝置中分離到2株鐵細(xì)菌，分別是大頭茶屬和腸桿菌屬。Xu等從循環(huán)冷卻水系統(tǒng)分離到一株鐵細(xì)菌為球衣菌屬。與以上研究結(jié)果對(duì)比，可見不同海域不同分離物中鐵細(xì)菌的種類差別較大。

    2.6 掛片銹層中優(yōu)勢(shì)好氧/兼性厭氧微生物分離

    結(jié)果目前大多學(xué)者都是對(duì)銹層中的SRB,IOB,硫氧化菌 （SOB） 等進(jìn)行研究,而本實(shí)驗(yàn)除了對(duì)SRB和IOB等腐蝕性細(xì)菌進(jìn)行分離外，還對(duì)銹層內(nèi)優(yōu)勢(shì)好氧/兼性厭氧菌進(jìn)行了分離鑒定。結(jié)果顯示其主要集中Vibrio sp.、Pseudoalteromonas sp.、Bacillus sp.、產(chǎn)微球莖菌屬 （Microbulbifer sp.）、交替單胞菌屬 （Alteromonas sp.）、發(fā)光桿菌屬 （Photobacterium sp.）、黏著桿菌屬 （Tenacibaculum sp.）、紅細(xì)菌科 （Rhodobacteraceae）、黃桿菌科 （Flavobacteriaceae）、α-變形桿菌 （Alpha proteobacterium）、腸桿菌屬 （Enterobacter sp.）、赤桿菌屬 （Erythrobacter sp.） 等20余個(gè)菌屬中 （表5）。弧菌屬細(xì)菌主要有溶藻弧菌 （Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌 （Vibrio parahaemolyticus）、以溶珊瑚弧菌 （Vibrio coralliilyticus）、強(qiáng)壯弧菌 （Vibrio fortis）、查氏弧菌 （Vibrio chagasii） 等。假交替單胞菌屬主要包括藤黃紫假交替單胞菌 （Pseudoalteromonas luteoviolacea）、殺魚假交替單胞菌 （Pseudoalteromonas piscicida）、Pseudoalteromonas phenolica、Pseudoalteromonas rubra等。全浸區(qū)分離的細(xì)菌種類均高于潮差區(qū)分離的。

    通過對(duì)比可見，本實(shí)驗(yàn)以弧菌屬、假交替單胞菌屬、芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌。與吳進(jìn)怡等認(rèn)為45鋼銹層中的微生物主要是由假單胞菌、弧菌、鐵細(xì)菌、硫桿菌和SRB組成；楊雨輝等通過實(shí)驗(yàn)箱進(jìn)行掛片分離到熱帶自然海水 （海南海口） 中需氧菌及兼性厭氧菌主要由假單胞菌屬、弧菌屬、黃桿菌科等細(xì)菌組成相比較，相同之處弧菌都是優(yōu)勢(shì)菌。其他結(jié)果不一致的原因可能是雖同為南海海域，但不同試驗(yàn)點(diǎn) （三亞、海口） 以及室內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件和自然條件下受到季節(jié)、氣候、波浪、海流及污染等的差異造成銹層內(nèi)微生物優(yōu)勢(shì)種類的不同。此外，與掛片所用的材料 （45鋼、Q235碳鋼） 也有關(guān)系。

    欒鑫等用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng) （PCR-RFLP） 方法研究青島近海實(shí)海全浸1 a的Q235碳鋼內(nèi)銹層細(xì)菌的多樣性，認(rèn)為銹層中優(yōu)勢(shì)菌為α-變形菌綱，主要包括玫瑰桿菌屬、赤桿菌屬、中慢生根瘤菌屬、α-變形菌等種類，這與本文中同樣在青島掛片分離到的紅細(xì)菌科屬于α-變形菌綱，以及赤桿菌屬和α-變形菌屬等鑒定結(jié)果有相同之處，但是大部分菌種不同，原因可能與分離方法及掛片周期不同有關(guān)。

    在本實(shí)驗(yàn)中，Pseudoalteromonas sp.在不同時(shí)空下不同腐蝕區(qū)帶均可以分離得到，這與呂建福等報(bào)道的假交替單胞菌屬是海洋潮差區(qū)和浪濺區(qū)混凝土表面的優(yōu)勢(shì)菌結(jié)果相一致。鑒于該菌是實(shí)海掛片銹層中普遍存在的微生物，本課題組已經(jīng)開展了關(guān)于其與腐蝕機(jī)理相關(guān)方面的研究。

    根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不同海域的微生物種類差異較大，但優(yōu)勢(shì)種類多數(shù)集中在弧菌屬、芽孢桿菌屬、假交替單胞菌屬等。這些種屬主要分布在海水、底泥及銹層中，因此在進(jìn)行防污殺菌實(shí)驗(yàn)時(shí)可以有針對(duì)性的選擇此類在海水環(huán)境中廣泛存在的微生物為研究對(duì)象。

    目前，關(guān)于傳統(tǒng)的涂板方法結(jié)合16S rDNA序列分析的方法分離實(shí)海掛片可培養(yǎng)微生物方面的報(bào)道不多，平板分離法分離到的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性研究不能完全覆蓋到樣品中所有菌群。但是，該方法不僅可以大致了解環(huán)境樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，還可以得到菌種，為后續(xù)研究工作提供支持。由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本文所獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌可能只是Q235碳鋼銹層內(nèi)細(xì)菌資源的一小部分，通過對(duì)培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度的優(yōu)化可分離得到更多的細(xì)菌資源。本實(shí)驗(yàn)所獲得的菌株對(duì)于后續(xù)腐蝕及污損微生物的篩選提供了一定的菌種庫，為后期開展腐蝕機(jī)理研究的實(shí)驗(yàn)提供了良好的菌種保證。

    3 結(jié)論

    （1） Q235碳鋼在不同海域不同腐蝕區(qū)帶的腐蝕速率不同，且隨時(shí)間的延長腐蝕速率均降低，潮差區(qū)的腐蝕速率總是大于全浸區(qū)的。銹層可分為內(nèi)銹層和外銹層，外銹層由Fe3O4,α-FeOOH和γ-FeOOH等組成，內(nèi)銹層主要含F(xiàn)e3O4;青島和三亞海域的腐蝕產(chǎn)物成分差別不明顯。

    （2） Q235碳鋼在不同時(shí)空下不同腐蝕區(qū)帶掛片腐蝕產(chǎn)物中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要包括SRB、鐵細(xì)菌和好氧/兼性厭氧菌等。全浸區(qū)銹層中分離的細(xì)菌種類和數(shù)量存在差異均多于潮差區(qū)的，且更易檢測到SRB存在。好氧/兼性厭氧菌種類豐富，以弧菌屬、芽孢桿菌屬、假交替單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)菌。

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責(zé)任編輯：韓鑫

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